AAV 核酸滴度 定量检测知多少

随着基因治疗技术日趋完善 和临床经验不断积累，监管机构 对基因 治疗产品的质量控制 也愈发严谨 慎微。 准确的滴度检测是 A AV 基因治疗药物质控的重要组成部分，也是开展临床研究的前提 条件， A AV 基因治疗临床试验检测方法汇总如下 表 。

	检测项目	检测方法
一般理化指标	外观	直接检测法
	pH	电位滴定法
	渗透压	渗透压测定法
纯度	蛋白含量	SDS-PAGE/ 银染
	病毒 颗粒聚集体	动态光散射
	空壳率	透射 电镜
	OD260/OD280	分光光度计法
	宿主 DNA 残留	q PCR
	质粒 DNA 残留	qPCR
	HKE293/BSA	ELISA
	核酸酶	ELISA
性能	核酸 滴度	qPCR
	转染效率 / 感染滴度	TCID50
	基因表达	ELISA
	体外活性
安全性	内毒素	凝胶限度试验法
	无菌	培养法
	复制型 AAV	培养法

其中 核酸滴度 检测是 以 AAV 衣壳中所含基因组作为定量依据，测定的是含有目标基因组的 A AV 浓度。 A AV 中包含的基因组是其表达蛋白或 R NA 的前提，是 A AV 药物发挥药效的核心和基础。 目前 AAV 核酸滴度 检测方法有 点杂交法、分光光度计法和 q PCR 法 ， q PCR 作为第二代 P CR 方法，是各大研究机构 和 药企最广泛 采用 的定量方法。 然而 q PCR 技术 存在 较大 局限性，如 检测结果只 是相对 标准曲线 的 “ 相对 ” 定量，且 反应容易 受 q P CR 体系 中酶或 蛋白等成分的干扰 ，定量结果不够精准等 。

 

dd PCR 方法 vs qPCR 方法

• 数字 P CR （ dd PCR ）被称为第三代 P CR 技术，与 qP CR 技术相比 具有 以下显著 优势：
•   dd PCR 无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量；
• dd PCR 有更高的准确度，定量 C V 值通常小于 10% ；
• d PCR 抗干扰能力更优，有实验显示， ddPCR 检测 A AV 样本的稳定性高于 qPCR 技术 [1] 。

qPCR 方法与数字 PCR 方法优劣势比较

 

另一组测试 数据 也 显示 [ 2 ] ， 优化后的 qPCR 方法中位 CV 分别为 5.35% 和 4.37% ，最大值分别为 33.2% 和 8.7% ， 而 数字 PCR 用 三个独立引物探针组的中位 CV 值为 2% 或更低，且分布更 密集，可见数字 PCR 方法定量更加准确，重复性更高。

 

从监管趋势 来 看 ，美国药典 在 细胞和基因治疗标准品章节中 明确写道， AAV 标准品定量将会使用数字 PCR 进行定量， 可见 数字 PCR 方法 在细胞和基因治疗 领域 中 绝对定量的 突出 优势。

 

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综上所述， 在 以 A AV 为 递送 载体的基因治疗产品 的 定量检测中， dd PCR 技术 已 受到 越来越多业内人士的青睐， 为了满足广大客户的需求，达普生物即将推出其自主研发的 AAV 基因组 ddPCR 精准定量试剂盒。 dafabetcasinoonline苹果手机网页版登录 科技有限公司作为达普生物中国总代理，现 携手 达普生物 开展 “ AAV 核酸滴度数字 PCR 定量试剂盒 免费测试活动 ” 。

 

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参考文献：

1. Dobnik, David, et al.2019:1570. ， Dobnik, David, et al. "Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors." Frontiers in microbiology (2019): 1570.
2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson . Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR . HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)