数字PCR系采用终点法对PCR扩增的结果进行测量。为了检测结果的变化，这个时候需要一种额外的物质指标--荧光来对结果进行测量判读。一般来说有两种荧光检测指标：探针法和染料法。探针法是当探针结合到目标序列上以后，聚合酶降解探针后，探针上自带的荧光基团离开淬灭基团，从而发出荧光。探针法的优点是特异性好，但是其合成价格相对较高。

染料法一般使用的是Evagreen染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料。 Evagreen 不会与单链DNA结合，且在失活状态下无荧光，只有与双链DNA结合才激活并发出荧光。因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生终点法检测的效果。

Bruijns et al.（10.1016/j.ab.2016.07.022）曾比对了多种菁荧光团的染料荧光，发现 Evagreen在低浓度的双链DNA检测中，具有极佳的检测线性。 Evagreen 对ssDNA结合力很低，保证了更高的信噪比 。而且 Evagreen 对 PCR反应的抑制更小，因此在实验中可以使用较高浓度，提高亮度的同时也消除了“染料重新分布”； Evagreen 染料法还可以 通过改变扩增产物的长度，或者调整引物的量等条件，实现多重数字PCR反应。

Evagreen染料法的实验设计及检测流程  

实验结果 分享：ddPCR染料法实验结果  

该实验是在某高校中心实验室里面使用达普星云数字PCR来对某基因进行定量检测，稀释了5个浓度梯度及阴性对照。结果显示，在5个浓度梯度下，检测结果符合预期，R 2 线性结果好。值得一提的是，数字PCR使用染料法操作简单方便，使用成本低。而且具有很高的检测灵敏度和优秀的重复性，反应检测限可低至0.5cp/μl。

达普生物科技，拥有多项液滴微流控专利技术，团队布局芯片、试剂、光路、软件等数字PCR全产业链，完全掌握数字PCR的每一个细节。现已上市的星云数字PCR系统Lite版，可以完美实现双色荧通道四重检测分析，并实现精准定量，达到国际领先水平。达普生物将会在近期推出新一代数字PCR系统Pro版，届时三个荧光通道，带来更多无限可能。

 

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