AAV 核酸滴度 定量检测知多少
随着基因治疗技术日趋完善 和临床经验不断积累,监管机构 对基因 治疗产品的质量控制 也愈发严谨 慎微。 准确的滴度检测是 A AV 基因治疗药物质控的重要组成部分,也是开展临床研究的前提 条件, A AV 基因治疗临床试验检测方法汇总如下 表 。
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检测项目 |
检测方法 |
一般理化指标 |
外观 |
直接检测法 |
pH |
电位滴定法 |
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渗透压 |
渗透压测定法 |
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纯度 |
蛋白含量 |
SDS-PAGE/ 银染 |
病毒 颗粒聚集体 |
动态光散射 |
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空壳率 |
透射 电镜 |
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OD260/OD280 |
分光光度计法 |
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宿主 DNA 残留 |
q PCR |
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质粒 DNA 残留 |
qPCR |
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HKE293/BSA |
ELISA |
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核酸酶 |
ELISA |
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性能 |
核酸 滴度 |
qPCR |
转染效率 / 感染滴度 |
TCID50 |
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基因表达 |
ELISA |
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体外活性 |
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安全性 |
内毒素 |
凝胶限度试验法 |
无菌 |
培养法 |
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复制型 AAV |
培养法 |
其中 核酸滴度 检测是 以 AAV 衣壳中所含基因组作为定量依据,测定的是含有目标基因组的 A AV 浓度。 A AV 中包含的基因组是其表达蛋白或 R NA 的前提,是 A AV 药物发挥药效的核心和基础。 目前 AAV 核酸滴度 检测方法有 点杂交法、分光光度计法和 q PCR 法 , q PCR 作为第二代 P CR 方法,是各大研究机构 和 药企最广泛 采用 的定量方法。 然而 q PCR 技术 存在 较大 局限性,如 检测结果只 是相对 标准曲线 的 “ 相对 ” 定量,且 反应容易 受 q P CR 体系 中酶或 蛋白等成分的干扰 ,定量结果不够精准等 。
dd PCR 方法 vs qPCR 方法
- 数字 P CR ( dd PCR )被称为第三代 P CR 技术,与 qP CR 技术相比 具有 以下显著 优势:
- dd PCR 无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量;
- dd PCR 有更高的准确度,定量 C V 值通常小于 10% ;
- d PCR 抗干扰能力更优,有实验显示, ddPCR 检测 A AV 样本的稳定性高于 qPCR 技术 [1] 。
qPCR 方法与数字 PCR 方法优劣势比较
另一组测试 数据 也 显示 [ 2 ] , 优化后的 qPCR 方法中位 CV 分别为 5.35% 和 4.37% ,最大值分别为 33.2% 和 8.7% , 而 数字 PCR 用 三个独立引物探针组的中位 CV 值为 2% 或更低,且分布更 密集,可见数字 PCR 方法定量更加准确,重复性更高。
从监管趋势 来 看 ,美国药典 在 细胞和基因治疗标准品章节中 明确写道, AAV 标准品定量将会使用数字 PCR 进行定量, 可见 数字 PCR 方法 在细胞和基因治疗 领域 中 绝对定量的 突出 优势。
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综上所述, 在 以 A AV 为 递送 载体的基因治疗产品 的 定量检测中, dd PCR 技术 已 受到 越来越多业内人士的青睐, 为了满足广大客户的需求,达普生物即将推出其自主研发的 AAV 基因组 ddPCR 精准定量试剂盒。 dafabetcasinoonline苹果手机网页版登录 科技有限公司作为达普生物中国总代理,现 携手 达普生物 开展 “ AAV 核酸滴度数字 PCR 定量试剂盒 免费测试活动 ” 。
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参考文献:
- Dobnik, David, et al.2019:1570. , Dobnik, David, et al. "Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors." Frontiers in microbiology (2019): 1570.
-
Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson
.
Absolute Determination of Single-Stranded
and Self-Complementary Adeno-Associated
Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR
.
HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)